한국혈전지혈학회는 10월 6일 대구인터불고호텔에서 제43차 추계학술대회를 열었다. 이번 학술대회 ‘Hemophilia and Rare Bleeding Disorders’ 세션에서 ‘A형 혈우병의 치료를 위한 유전자 치료 및 세포 치료’, ‘Emicizumab 치료 중 돌발 출혈과 수술의 관리’, ‘AHA 치료를 위한 recombinant porcine FVlll의 활용’ 주제로 발표된 강의 내용을 요약·정리해 게재한다.      1. A형 혈우병의 치료를 위한 유전자 치료 및 세포 치료   박철용 박사(연세의대)     2. Emicizumab 치료 중 돌발 출혈과 수술의 관리     박영실 교수(경희의대)     3. AHA 치료를 위한 recombinant porcine FVlll의 활용      현신영 교수(연세의대)

 

  

1. A형 혈우병의 치료를 위한 유전자 치료 및 세포 치료

박철용 박사(연세의대)

 

▲ 박철용 박사(연세의대)

역분화 줄기 세포는 무엇인가?

CRISPR-Cas9 및 patient-derived iPSCs를 이용한 A형 혈우병 치료에 대한 기초 연구 자료를 소개하고자 한다. 제가 주로 연구하는 분야는 줄기 세포 중 iPSCs(induced pluripotent stem cells)로서, 역분화 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포라고 불린다. 이 세포는 완전히 분화된 세포에 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc를 과발현시켜서 분화되기 이전의 세포(pluripotent cell)로 되돌린 세포를 말한다.

 

체세포에서 분화되기 이전으로 되돌린 iPS 세포는 pluripotent하므로 배아 줄기 세포처럼 다시 여러 유형의 체세포로 분화할 수 있다. 이 세포가 각광 받는 이유는 배아 줄기 세포는 만들기가 상당히 까다로운데 비해 iPSCs는 비교적 쉽게 만들 수 있기 때문이다. 따라서 최근에는 iPSCs를 이용한 여러 가지 연구가 활발하다. 현재까지 다양한 체세포를 이용하여 iPSCs를 만들 수 있었고 reprogramming factor도 다양한 방법으로 세포 내로 전달하는 데 성공했다(Pharmaceutics, Bailly et al., 2022). 

 

최근에는 중국 연구자들이 reprogramming 유전자를 사용하지 않고 reprogramming 유전자를 활성화시키는 small molecule만으로 성공한 사례도 발표된 바 있다(Nature, Guan et al., 2022). 

 

이와 같은 방법으로 제작한 환자 특이적 iPSCs를 어떻게 활용할 수 있을까? 환자에서 얻은 iPSCs는 질병의 phenotype을 가지고 있으므로 질병의 modeling을 해서 발병 기전을 밝히거나 신약 개발에 활용할 수 있고, cell therapy source로 활용할 수도 있다(Cell Mol Life Sci, Sugimoto et al., 2021). 그러나 유전적 결함(genetic defect)을 가진 세포를 세포 공급원(cell source)으로 쓸 수 없으므로 유전자 교정(gene correction)이 필요하다. 이를 위해서 engineered nuclease를 많이 쓰고 있다. Engineered nuclease는 말 그대로 DNA를 자르는 nuclease인데, DNA의 특정 염기 서열을 인식하기 위한 짧은 guide RNA과 nuclease 활성을 가지는  Cas9 단백질이 협력하여 nuclease로 활동하게 된다(Li et al., 2020).

 

Nuclease는 DNA를 자르기만 한다. 그 후에는 세포가 갖고 있는 repair system에 의해 indel이 발생할 수 있다. Indel(in+del, 필요시 삭제해도 됩니다)은 DNA가 잘린 부위에 insertional mutation 또는 deletion mutation이 생기는 것을 의미한다. 즉, mutation을 쓰는데 활용할 수 있다. 반면 잘린 부위의 서열과 유사한 서열을 존재할 경우 상동 재조합(homologous recombination; HR)이 고효율로 일어날 수 있다. 동일한 서열이 있는 경우 nuclease에 의해 잘리지 않더라도 HR이 일어나긴 하지만 그 효율이 DNA가 잘려져 있는 상황과 비교해 현저히 낮아 상동 재조합을 기대하기가 어렵다. 그러나 동일한 서열이 있는 상태에서 해당 부위가 잘리면 HR이 고효율로 발생되어 변이 서열을 정상 서열로의 변경이 상대적으로 쉬워지게 되는 것이다(Nat Biotechnol, Sander et al., 2014)

(참고사항, 100여개의 염기서열에 해당하는 조각을 HR 유도에 사용하고, 100여개 서열중에 1-2개 서열이 다른 것은 동일한 서열이라고 인식됨(세포의 repair system에 의해). 1-2개의 서열을 다르게 하는 이유는 정상 서열을 바꾸어 변이를 주거나, 변이 서열을 바꾸어 정상 서열로 교정하기 위해 1-2개 다른 서열을 사용함. 유전자 가위로 염색체 DNA가 잘려 있는 상태에서 잘린 주변의 서열과 유사한 100여개 염기로 구성된 DNA 조각이 있을 경우 HR 효율이 크게 증가함). 

 

최근에는 특정한 부위의 특정한 서열을 특정한 서열로 바꿔주는 genome editing tool이 개발되었다. 이 기술은 deaminase를 이용해서 염기 서열을 바꿀수 있는 base editor,  역전사 효소(reverse transcripase)를 이용해서 염기 서열을 바꿀수 있는 prime editor가 각각 개발되어 있다(Trends Biotechnol, Zhao et al., 2023). 이와 같은 기술은 기초 연구뿐만 아니라 임상적으로도 쓸 수 있고,  In vivo 및 ex vivo에서 gene editing을 효과적으로 유도할 수 있다. 환자의 체세포로부터 iPSCs를 만들고 유전자 변이 부위를 유전자 가위로 절단하고 교정하는 것이다(Blood, Hoban et al., 2016). 

 

A형 혈우병 세포 치료의 개념

FVlll 결핍에 의한 A형 혈우병 치료에 관심을 갖고 있다. A형 혈우병 환자가 갖고 있는 독특한 inversion 유전자에 관심이 있는데, 중증 환자의 거의 절반이 inversion에 의해 발생할 정도로 다른 변이 형태와 비교해 상대적으로 환자 수도 많기 때문이다. 

고식적인 혈우병 치료의 기본은 혈액 응고 인자를 보충하는 것이고 응고 인자의 반감기를 연장하기 위한 다양한 기술도 개발되었다. 

 

최근에는 비-응고 인자 요법(non-factor therapy)도 도입되었다. 그러나 아직 세포 치료에 대한 연구는 아직 미흡하므로 이 분야를 열심히 연구하고 있다. 

A형 혈우병 세포 치료를 위한 세포 공급원으로는 다양한 세포를 활용할 수 있지만, 제 연구는 환자 유래 iPSCs를 만들어서 뒤집어진(inversion) 변이 유전자를 교정 후 증식•분화시켜 FVlll이 발현되는 혈관내패세포 유형으로 만들어서 이를 다시 환자에게 주입시키는 치료법이다. A형 혈우병 환자의 독특한 유전자 변이의 약 50%는 point mutation이고, intro 1 또는 intron 22 inversion이 37%, small deletion 또는 insertions, large deletion이 15% 가량을 차지한다. 단, 중증 환자는 inversion을 가지고 있는 비율이 절반 정도로 높다. 저는 유전자 가위를 가지고 inversion을 어떻게 교정할 것인지에 대해 꾸준히 연구하였다. (그림 1)에서 보듯이 exon1과 exon2 사이에 intron1이 존재하는데, intron 1의 특정 염기 서열과 동일한 서열이 upstream에 하나 더 존재하여 상동 재조합에 의해 inversion 된다. 

 

Inversion은 recombination에 의해 일어나므로 nuclease로 해당 부위를 잘라주면 HR이 증가하여 inversion된 부위가 다시 inversion 되지 않을까 생각했다. 또한 HR에 의한 editing은 에러가 적기 때문에 에러 없이 recombination을 한번 더 유도하여 inversion된 부위를 교정할 수 있을 것이라 생각한 것이다. 

 

첫 번째 논문은 intron 1을 교정한 사례를 2014년 PNAS에 발표하였다. 그 당시에는 환자의 세포를 얻지 못해서 정상인의 세포에서 해당 부위를 인식하는 유전자 가위를 이용해서 잘랐다. 자르고 확인해 보니 뒤집어진 유전자형을 확인할 수 있었고, 염기 서열을 확인해보니 뒤집어져 있기만 할 뿐 유전자 가위가 인식하는 부위에 그 어떤 변이도  없었다. 그래서 동일하게 한 번 더 잘라 준다면  뒤집어진 서열을 교정할 수 있다고 생각했다. 이와 같은 방법으로 정상 세포에서 환자의 genotype을 가진 세포를 만들고, 이를 다시 inversion시키면 reversion됨을 확인할 수 있었다. 이후 11명의 혈우병 환자로부터 소변 샘플을 얻었고 이로부터 intron 1 inversion과 intron 22 inversion 세포를 확보할 수 있었다. 이 중 총 3명의 환자 유래 세포로 부터 iPSCs을 만들었고 특성 분석을 하여 제대로 만들어 졌는지 확인하였다.

 

사실 intron 22 inversion은 intron 1보다 더 복잡하다. Intron 1 inversion은 homologous sequence가 2개인데 비해 intron 22 inversion은 3개를 갖고 있다. 이 경우 homologous sequence 안쪽을 자르면 원하지 않는 경우의 수가 너무 많이 발생한다. Intron 22 inversion은 intron 22 homologous sequence 1번과 3번 간의 inversion이 주로 발생하므로, 1번과 3번의 homologous 서열과 최대한 가까우면서도 바깥의 고유한 서열을 인식하는 유전자 가위 2개를 제작하였다. 이렇게 해서 교정을 하면 완전히 정상인 세포와 동일하게 교정되지는 않지만, 유전자 발현 측면에서 보면, exon의 방향이 동일하게 되므로 정상적인 8번 응고인자에 대한 mRNA가 만들어 질 수 있다. 이를 실험적으로 증명하였고 혈관 내피 세포(endothelial cell; EC)를 분화시켜 혈우병 마우스 모델에 주입해 보았다. 그 결과, 혈중 FVlll 활성이 증가되었고 생존 기간도 연장되었다. 따라서 세포 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 

 

이 실험에서 확보한 내피 세포가 구체적으로 어떤 특징을 가지고 있으며 체내에서 얼마나 오래 기능을 발휘할지, 얼마나 증식할 수 있으며 얼마나 안전한지 등에 대한 과제를 계속 해결해야 했다. 이를 위한 후속 연구를 진행하였다. 

이 때부터는 고려대학교 김종훈 교수님 연구실의 손정상 박사와 협업하기 시작하였다. 선행 연구 논문들을 분석하여 EC를 효과적으로 분화시킬 수 있는 프로토콜을 정립하고자 하였고, 최종적으로 3단계에 걸친 프로토콜을 개발할 수 있었다(Biomaterials, Son et al., 2022). 

 

미분화 줄기세포를 분화시켜 중배엽(mesoderm)을 얻고 VEGF 처리를 하여 early endothelial cell을 만든다. 이 세포를 특정한 배지에서 배양하고 그 중간에 특정한 마커로 sorting하여 순도를 높였다. EPC 마커로 VEGFR 못지 않게 CD31+도 많이 쓰이고 있다. 

이 두 가지의 특징을 조사해 보니, VEGFR로 sorting한 경우에는 세포 생존율 그리 높지 않았다. 또한 특정 EC 마커는 확인 가능하지만 대부분의 EC 마커는 나오지 않았고 이질적인(heterogeneous) 세포가 많았으며 근육 세포가 대부분이었다. 따라서 연구실에서 원하는 세포를 얻기 어려웠다. 반면, CD31+ sorting으로 얻은 세포는 연구에 필요한 phenotype을 많이 가지고 있었다. 

 

5일후부터 CD31+ 세포가 52% 정도되었고 이를 추가 배양할 때 원활하게 증식하였으며 EC 마커도 높게 발현되는데 비해 근육 세포 특이적 마커는 거의 발현되지 않았다. 배지 조성을 조정하고 VEGF 농도도 조정하였다. Stemline ll 배지 조건에서 VEGF ligand를 50ng/mL로 투여하면 세포 증식이 가장 원활하고 EC 마커 발현도 가장 활발하였다. 그러면 CD31- 세포는 어떤 유형으로 분화되는 것일까? 

 

확인해 보니 이들은 주로 근육 세포로 분화하였다. EC에 대한 추가적인 특성 분석을 위해 증식 능력을 확인하였다. 0일부터 5일까지 확인한 결과, 0.5 x 104이 거의 5 x 104까지 증가하여 약 10배 증가하였다. 이후에는 계대 배양을 하였는데, P1~P5까지 확인하였을 때 P3부터 증식 능력이 다소 감소하였으나 여전히 증식은 하고 있었다. 세포 치료제로 개발하려면 동결했다가 해동되었을 때에도 증식 능력을 보유하고 있어야 한다. 이를 확인했을 때 동결 후 해동하면 증식력이 동결 전에 비해 약간 감소하긴 하지만 증식력은 갖추고 있었으며 EC 마커도 잘 발현되었다. 

 

한편, EC 세포는 염증성 cytokine의 자극을 받으면 활성화되어 혈액 중의 림프구와 반응하는 adhesion molecule gene expression이 증가한다. 이러한 EC 고유의 특징도 여전히 갖추고 있는지 확인해 보았는데, 같은 특성을 보이고 있음을 확인하였다. 

 

또 다른 EC의 특징 중 하나는 AcLDL을 uptake하는 것인데, 이 역시 잘 갖추고 있음을 확인하였다. 이러한 연구를 진행할 무렵 타 연구진으로부터 새로운 보고가 있었다. CD157+ EC이 혈관 재생에 매우 중요하고 FVlll expression이 높으며, 실제로 혈우병 모델 마우스에 이 세포를 이식했을 때 혈액 응고 효과가 뛰어나다고 하였다(Cell Stem Cell, Wakabayashi et al., 2018). 

 

그래서 연구진이 확보한 CD31+ 세포에서 CD157+의 발현이 어느 정도인지 확인해 보았는데, 80~90%가 CD157+인 것을 확인하였다. 즉, CD157+ EC의 특징을 어느 정도 공유하고 있다고 볼 수 있겠다. 

다음으로는 저희가 확보한 CD31+ EC에서의 FVlll 단백질 발현과 그 활성도 확인하였다. FVlll expression이 가장 높다고 알려져 있는 LSEC만큼은 아니지만 교정된 세포에서 높은 FVlll 단백질발현을 보였고 교정된 EC는 교정되지 않은 EC보다 현저하게 높은 활성을 보였다. 

 

그다음으로 In vivo assay를 위해 실험을 계획하였다. 결함이 있는 iPSCs와 교정된 iPSCs로부터 앞서 소개한 프로토콜에 따라 EC를 분화하여 고용량(4 x 106) 또는 저용량(2 x 106)으로 나누어 마우스 뒷다리 허벅지에 주사하였다. 2주 후 치료 효과를 확인하였다. 이 때 통상적으로 사용하는 방법은 tail-clip assay였으나 2016년 새로 개발된 tail vein transection bleeding test를 활용하였다. 

 

이 방법은 마우스 꼬리 측면에 있는 정맥 하나만 자르고 혈소판에 의한 1차 지혈에 의해 생기는 clot을 제거하여 2차 출혈을 유발한다. 2차 지혈을 위해서는 응고 인자가 활성화되어야 하므로 이 방법을 이용하면 1차 지혈과 2차 지혈을 구분하여 효과를 판정할 수 있다. 아무 처치도 하지 않은 마우스를 대조군으로 두고, 위약을 투여한 군, 결함이 있는 환자 iPSCs에서 분화된  EC를 이식한 군, 교정된 iPSCs에서 분화된 EC를 이식한 군, 총 4군으로 나누어 tail vein transection bleeding test를 실시하였다. 

 

1차 출혈을 유도하고 60분 동안 15분 간격으로 3차례의 자극을 주었다. 즉, 최초로 형성된 clot을 제거하고, 15분 후 다시 생긴 clot을 또 제거하고 15분 후 또 다시 clot을 제거한 것이다. 이렇게 하면서 어느 정도의 출혈이 생기는지 조사하였는데, 1차 지혈 시에는 환자의 iPSCs에서 분화된 EC나 교정된 EC를 주입한 군이 큰 차이가 없었다. 그러나 clot을 제거하기 전에 또 다시 출혈이 시작되는 재출혈(rebleeding) 횟수는 환자의 iPSCs에서 분화된 EC를 주입한 마우스군에서 현저하게 많았다. 

Clot을 반복적으로 제거할수록 교정된 EC를 고용량으로 주입한 마우스군의 재출혈이 적고 출혈 시간도 단축됨을 확인하였다. 

 

한편, tail clip assay를 통해 bleeding time도 조사하였는데, 교정된 EC를 고용량 주입한 마우스에서 출혈 시간이 현저하게 줄어들었고 생존율도 역시 향상되었다. 실험 마우스들의 혈액을 채취하여 혈중 FVlll 활성을 측정해 보았다. 

위약 투여군이나 환자의 iPSCs에서 분화된 EC를 주입한 군의 FVlll 활성은 1% 미만인데 비해 교정된 EC를 주입한 군의 FVlll 활성은 드라마틱하게 향상되어 있었다. (그림 2) 

 

그러면, 이렇게 이식된 세포는 체내에서 얼마나 오래 살아남을 수 있을까? 이식 전 미리 형광 염료로 labeling을 하고 영상 검사로 확인한 결과, 60일까지 살아남을 수 있는 것으로 파악되었다. 100일 후 clotting assay도 해 보았는데 교정된 EC를 주입한 마우스의 tail clip assay에서 지혈되는 데 5분이 걸린 데 비해 환자 iPSCs에서 분화된 EC를 주입한 마우스는 약 60분 후에도 출혈이 멈추지 않았다. EC를 이식한 후 해당 마우스로부터 이식부위의 조직을 검사한 결과, 종양은 없었고 혈관 네트워크도 정상적으로 형성되어 있었다. 

 

이후 연구실에서 LOGD(liver ganoid)를 만들어 EC와 동일한 방법으로 마우스에게 이식하고 효과를 비교해 보았다. EC 세포를 이용한 방법에 비해 효과가 다소 떨어지긴 하지만 organoid system도 치료에 활용하는 데 가능성이 있을 것으로 사료된다. 

 

결론 및 요약

본 연구를 통해서 CD31+ EC를 효과적으로 분화 및 분리하는 프로토콜을 확립하였고, 이 방법으로 분리한 세포에서 EC가 갖추어야 할 많은 특성들을  확인할 수 있었다. 이렇게 분화된 EC를 A형 혈우병 마우스 모델에 이식을 했을 때 혈액 내 FVlll 활성이 증가하였고 이식된 세포는 약 3개월까지 생존함을 확인하였다. 저용량은 고용량에 비해 효과가 낮으므로 적정한 용량을 추후 확인할 필요가 있겠다. 앞으로 유전적 결함을 교정한 iPSCs가 혈우병 치료를 위한 세포 치료제로 개발할 수 있게 되기를 기대한다. ●